Presipitasi protein (Salting In dan Salting Out)

Salting Out

Salting Out adalah Peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih besar dibanding zat utama, akan menyebabkan penurunan kelarutan zat utama atau terbentuknya endapan karena ada reaksi kimia. Contohnya : kelarutan minyak atsiri dalam air akan turun bila kedalam air tersebut ditambahkan larutan NaCl jenuh.

Salting In

Salting in adalah adanya zat terlarut tertentu yang menyebabkan kelarutan zat utama dalam solvent menjadi lebih besar. Contohnya : Riboflavin tidak larut dalam air tetapi larut dalam larutan yang mengandung Nicotinamida.

Presipitasi protein adalah pengendapan yang terjadi karena penggumpalan yang parsial. presipitasi disebabkan oleh berkurangnya kelarutan protein (perubahan fisik) yang terjadi karean perubahan kimia. Seperti halnya denaturasi protein, presipitasi juga disebabkan oleh factor kimia dan fisika. Semua faktor yang terjadi pada denaturasi juga terjadi pada presipitasi protein. Semua faktor yang dapat menimbulkan denaturasi protein, juga dapat menyebabkan perubahan kelarutan protein. Dengan demikian presipitasi protein merupakan fenomena fisika yang disebabkan oleh perubahan struktur kimia. Presipitasi disebabkan oleh pengembangan molekul protein akibat unfolding atau membukanya heliks-heliks protein. Presipitasi juga terjadi akibat terganggunya kesetabilan koloid yang disebabkan oleh menurunnya muatan elektrostatik protein sehingga gaya gravitasi akan lebih dominan dibandingkan gaya tolak-menolak antar molekul. Kesimpulannya adalahg presipitasi protein merupakan fenomena berkurangnya kelarutan suatu protein yang disebabkan oleh perubahan struktur kimia.

Metode Salting-in dilakukan dengan menambahkan garam yang tidak jenuh atau pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan peningkatan konsentrasi garam, apabila konsentrasi garam ditingkatkan terus, maka kelarutan protein akan turun, pada konsentrasi garam yang lebih tinggi,protein akan mengendap.

Pengendapan pada metode salting-out terjadi karena proses persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Grup ion pada permukaan protein menarik banyak molekul air dan berikatan dengan sangat kuat. Contohnya Amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan protein akan menyebabkan tertariknya molekul air oleh ion garam. Hal tersebut disebabkan ion garam memiliki densitas muatan yang lebih besar dibandingkan protein. Kekuatan ionic garam pada konsentrasi tinggi semakin kuat sehingga garam dapat lebih mengikat molekul air. Menurunnya jumlah air yang terikat pada protein menyebabkan gaya tarik menarik antara molekul protein lebih kuat bila dibandingkan dengan gaya tarik menarik anatara molekul protein dan air (mempertinggi interaksi hidrofobik), sehingga protein akan mengendap dari larutan atau berikatan dengan kolom hidrofobik. Selama proses salting-out, konsentrasi garam harus tetap dijaga agar tidak menurun dalam larutan sehingga tidak terjadi pengendapan yang bersamaan antara protein yang ingin dimumikan dan protein yang tidak diinginkan.

STRUKTUR DAN FUNGSI MEMBRAN SEL

Lipid dan protein merupakan bahan penyusun utama membran, walaupun karbohidrat juga merupakan bahan penting. Akhir-akhir ini, model yang dapat diterima untuk penyusunan molekul-molekul tersebut dalam membran adalah model mosaik fluida. Membran plasma atau membran sel tersusun atas molekul lemak dan protein. Molekul lemak terdiri atas dua lapis, terdapat di bagian tengah membran. Di sebelah luarnya terdapat lapisan protein perifer (protein tepi), yang menyusun tepi luar dan dalam membran. Selain protein perifer, terdapat pula molekul-molekul protein tertentu yang masuk ke dalam lapisan lemak. Bahkan ada yang masuk hingga menembus dua lapisan lemak. Protein yang masuk ke lapisan lemak itu disebut protein integral. Pada tempat-tempat tertentu, terbentuk pori yang dibatasi oleh molekul protein. Tebal membran plasma antara 5-10 nm.

Protein transmembran

Protein ini terintegrasi pada lapisan lipid dan menembus 2 lapisan lipid / transmembran. Bersifat amfipatik, mempunyai sekuen helix protein, hidrofobik, menembus lapisan lipida, dan untaian asam amino hidrofilik. Banyak diantaranya merupakan glikoprotein, gugus gula pada sebelah luar sel. Di sintesis di RE, gula dimodifikasi di badan golgi.

Ekspresi gen pada Eukariot

Pada dasarnya sistem transkripsi maupun translasi pada prokariot maupun eukariot sama. Sama-sama memerlukan DNA templat, RNA polimerase, NTP (ribonukleotida) dan molekul protein regulator. Bahkan keduanya pula terdapat tahapan inisiasi, elongasi, dan terminasi. Tapi di sini saya akan menjelaskan lebih banyak tentang eukariot.

Pada proses transkripsi, perbedaan yang paling mendasar antara prokariot dan eukariot adalah tempatnya. Pada eukariot terdapat di inti sel dan pada prokariot di sitoplasma. Hal ini dikarenakan menurut struktur selnya, eukariot mempunyai membran inti dan prokariot tidak. Sehingga diketahui pula pada eukariot gen-gennya tersebar pada kromosom. Selain itu eukariot bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Sedangkan pada prokariot bersifat polysistronik yang dalam satu transkrip mengkode beberapa macam produk ekspresi. Pada struktur gen eukariot pun berseling-seling : Intron (sekuen mengkode tidak spesisifik) – Ekson (sekuen mengkode spesifik) – Intron, dan pada prokariot tidak. Produknya pun pada eukariot terdapat tiga macam RNA polimerase yaitu tRNA, rRNA, dan mRNA. Sedangkan pada prokariot menghasilkan produk satu macam RNA saja.

Pada proses inisiasi pada eukariot, tipe enzim RNA polimerase pada eukariota lebih kompleks. Dari 3 tipe enzim yang paling banyak dipelajari adalah polimerase yang akan menghasilkan mRNA. mRNA harus mengalami pemasakan terlebih dahulu yang melibatkan proses yang kompleks disebut prosesing. Prosesing meliputi penambahan ‘tudung’ pada ujung 5’ dan ‘ekor’ pada ujung 3’, dan pemotongan (splicing) hasil awal transkrip mRNA (pre-mRNA) berukuran sangat besar. Ada 3 elemen yang ditambahkan dalam polimerisasi tersebut, yaitu:

• TATA box (Goldberg-Hogness box)

Posisinya 30 pasang basa (pb) sebelum titik transkripsi (-30). Konsensus urutan ini adalah heptanukleotida (tersusun atas 7 nukleotida) yang hanya mengandung A dan T (TATAAAA). TATA box bertanggung jawab terhadap penempelan awal supaya terjadi denaturasi pita ganda DNA. Hal ini didukung oleh kenyataan bahwa pasangan A-T tidak sestabil pasangan G-C, karena pasangan A-T hanya mempunyai dua ikatan hidrogen dan G-C mempunyai tiga ikatan hidrogen.

• CAAT box

Terletak sebelum promoter, pada beberapa gen sekitar 80 nukleotida sebelum titik transkrip (-80). Urutan nukleotidanya adalah GGCCAATCT. CAAT bersama dengan TATA box mempengaruhi efisiensi promoter.

• DNA enhancer

Lokasinya bervariasi (jauh di hulu gen, sesudah gen, bahkan di dalam gen itu sendiri). Selain enhancer, elemen pengatur lain yang dapat mempengaruhi ekspresi suatu gen adalah silencer, yang dapat menghambat ekspresi suatu gen. Suatu elemen dapat bersifat sebagai enhancer maupun sebagai silencer, tergantung pada protein yang menempel. Contohnya saja sistem hormon tiroid, elemen yang menentukan tanggapan hormon tiroid akan bersifat sebagai silencer jika receptor hormon tiroid terikat pada elemen tersebut tanpa bersama-sama dengan ligannya (hormon tiroid).

• Faktor lain yang disebut trans-acting factors

Perlengkapan ini memfasilitasi penempelan (tahap inisiasi) trans-acting factor berupa protein, pada manusia faktor transkripsi ini diberi nama TFIIA, TFIIB, dst. Salah satu TF yaitu TFIID terikat pada TATA box disebut TATA-binding protein (TBP).

Pada proses translasi mRNA eukariota berumur lebih panjang (jam) dibanding mRNA prokariota (menit). Pada ujung 5’ mRNA eukariota ditambahkan ‘tudung’ yaitu 7-metilguanosin. Fungsi tudung ini adalah untuk efisiensi translasi. mRNA eukariota mempunyai urutan pengenal 5’-ACCAUGG disekitar kodon inisiasi AUG. Urutan ini disebut urutan Kozak (Marilyn Kozak). Pada prosesnya tidak memerlukan amino acid formylmethionine pada waktu inisiasi, tetapi kodon startnya tetap AUG, sehingga tRNA awal adalah tRNA-met. Faktor protein untuk inisiasi, elongasi dan terminasi sama dengan pada prokariota, tetapi jumlah yang diperlukan lebih banyak. Pada eukariota mempunyai ER. Struktur ER memungkinkan ribosom menyalurkan proein yang baru disintesis ke dalam saluran yang ada pada ER. Lain halnya dengan prokariot yang tidak mempunyai ER.